分离分析的一个基本要求是能够验证分离物质的纯度,也就是说,确保没有共洗脱的杂质对目标峰响应值得干扰。峰纯度的确认应在定量之前完成。忽视峰纯度确认意味着在质量控制中,一个杂质隐藏在目标峰下可以造成结果失真,或者在研发过程中重要信息可能丢失。在分析方法验证项目(专属性、线性、定量限、检测限、精密度、耐用性)中峰纯度也是需要同时检查的。
接下来我们来看色谱分析两大仪器品牌不同峰纯度的确定方法吧。
Waters
整个峰的纯度由纯度角和阈值角决定。
峰纯度:纯度测试将校正峰顶点处的光谱波形和整个峰的光谱波形,并进行比较。如果峰中间的光谱形状不同,首先应考虑可能与峰光谱波形不同的其它组分与之共洗脱。
纯度角:光谱一致性的一种衡量方法,即将积分峰上每个数据点的光谱与峰顶点光谱进行对照,计算出峰各处的光谱与峰顶点光谱之间的夹角的加权平均值。整个峰的纯度可以通过该值确定。纯度角的范围是从0 ~90度。值小(特别在小于阈值时)表明光谱均匀。值大表明不均匀程度较大
注意事项
1、如果观察到高纯度标准品的纯度不佳,可能是由以下几个主要原因造成的:
A浓度过高
即使只在部分波长下的吸光度超过1AU,也会破坏吸光度线性,导致光谱出现畸变,得到较差的纯度。请降低浓度,确保大吸收波长处的吸光度不超过1AU,然后再次进行测量。
A 流动相的背景吸光度高
如果在低波长下流动相的背景吸光度比较大,则该波长下吸光度的线性范围较小,测得的光谱会发生畸变。在这种情况下,请在处理方法的“纯度”选项卡上缩小要计算的波长范围,然后重新处理。或者避开背景吸光度较大的波长,然后重新测量。
2、 光谱差异的组分应同时洗脱。
检测不到共洗脱的主要原因是光谱相似、含量极少的组分共洗脱,但即使共洗脱组分的光谱差异很大,也可能无法被检测到。那就是共洗脱组分均匀地与主要组分峰重叠的情况。在这种情况下,以相同比率共洗脱的组分在峰基线和峰顶点处与主要组分重叠,而峰基线和峰顶点是判定峰的标准。简而言之,各谱图的波形与两个波形的总和相同,且比率相同。纯度测试无法检测到这种情况。
Agilent
1、将不同波长下采集的色谱图进行对比去寻找不一致的色谱峰。良好的重叠,其中峰形、保留、保留时间匹配,则表示纯峰;而较差的重叠表示不纯峰,如图 1 所示。
2、除了叠加信号外,还应计算它们的比率,并且绘制比率图。生成的比率图是峰值的敏感指标纯度。任何理想矩形的失真比例图的形式表示杂质。
3、安捷伦的Chemstation软件可以通过计算相似因子来确定峰纯度情况。
其中:和分别是在相同波长下采集的第一个和第二个谱图的吸收值;
和分别是第一个和第二个谱图的吸收均值;
N是采样点个数。